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原理
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人BrdU单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的BrdU与单抗结合,加入生物素化的抗人BrdU,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,BrdU浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中BrdU浓度。
试剂盒组成(2-8℃保存)
准备试剂与收集血样
1.收集标本:血清、血浆(EDTA)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存,避免反复冻融。
2.标准品液配制:使用前加入0.5ml蒸馏水混匀,配成2nmol/ml的溶液。设标准管8管,第一管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入2nmol/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
4.洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)
标本激活方法
1.将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。
2.加20ul1NHCI,盖紧,上下混匀。2-8℃放置60±2分钟。
3.加20ul1NNaOH,盖紧,上下混匀。
4.即用,或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。(注意:不同的标本BrdU的水平可能有较大差异,请根据实际情况灵活掌握稀释度)
5.细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液+50ul样本+20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH)。
检测程序
1.加样:每孔各加入标准品或待测样品(已激活)100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.洗板:同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.洗板:同前。
7.每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0pmol/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应BrdU含量,再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
1.灵敏度:最小的BrdU检测浓度小于1.5pmol/ml。
2.特异性:可同时检测重组或天然的人BrdU。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3.重复性:板内、板见变异系数均小于8.9%。
注意事项
1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。
2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
3.板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。
4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。
5.本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!
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